采用Biolog公司生产的Biolog-Eco微平板分析不同劣化程度土壤中细菌群落的代谢特征。Biolog-Eco板是有31种碳源的生态板，每种碳源3个重复，从4 ℃冰箱中取出后于室温预热30 min备用。称10 g土壤样品，加入90 mL无菌生理盐水，摇床振荡30 min后，用移液枪吸取5 mL溶液，加入装有45 mL无菌水的三角瓶中进行100倍稀释。在超净工作台内向Biolog-Eco平板各小孔中加入150 μL的样品，置于25 ℃恒温培养，每隔24 h于波长为590 nm和750 nm的Biolog读数器上读数，整个培养过程共持续7 d[-]。
各土壤样品的平均光密度值(Average well color development，AWCD)的计算方法：AWCD=∑[(Ci− R)590−(Ci−R)750]/31，其中Ci是第i反应孔的吸光值，R是对照孔的吸光值，31是Biolog-Eco板中的底物数量[]。
1.3.3 微生物多样性计算方法及统计分析选取72 h平均光密度值(AWCD)计算不同土壤样品中微生物群落多样性指数[, ]：
Shannon指数(H ′)=−∑(Pi×lnPi)；
Simpson多样性指数(D)=1−∑(Pi)2；
McIntosh多样性指数
式中：Pi为第i孔相对光密度值与整个平板相对吸光度值总和的比值；ni是第i孔的相对吸光值(Ci−R)；选取72 h平均光密度值(AWCD)应用Canoco 5.0进行微生物群落碳源代谢特征的主成分分析(Principal component analysis，PCA)。
1.4.1 总DNA和RNA提取称取0.5 g土壤样品按照操作手册使用FastDNA® SPIN Kit for Soil提取土壤总DNA，获得的DNA于−20 ℃保存备用。按照操作手册使用RNA PowerSoil® Total RNA Isolation Kit提取土壤总RNA，对获得的总RNA按照Thermo公司试剂盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit说明书进行反转录，所得的cDNA和RNA于−80 ℃保存备用。
1.4.2 PCR扩增采用巢氏PCR对目标片段进行扩增。第一轮PCR扩增的引物为21f (5′-AGAGTTTGATCMTGG CTCAG-3′)和1492r (5′-TACGGYTACCTTGTTACG ACTT-3′)[]，第二轮所用的引物为F-968-GC (5′-CG CCCGGGGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGAACGCGAAGAACCTTAC-3′)和R-1401 (5′-CGGTGTGTACAAGACCC-3′)[-]。两轮的PCR反应体系与条件均参照Gu等[]的方法进行。PCR产物用1.0%的琼脂糖电泳检测，目标片段大小约为500 bp。
1.4.3 PCR-DGGE产物检测与指纹图谱分析DGGE丙烯酰胺凝胶强度为8%，变性剂梯度为30%−70%。凝胶板制作好之后，组装放入含有1×TAE的电泳槽中，预热到60 ℃时点样。每孔加入20 μL PCR产物，点样完成后，先50 V预电泳30 min，然后在60 ℃、180 V下电泳6 h。电泳结束后取出凝胶，使用银染法进行染色[]后进行拍照。采用Bio-Rad公司的Quantity One软件(V4.5)对DGGE条带进行数字化分析，评价金沙土遗址不同劣化土壤微生物的群落结构。
1.4.4 DGGE条带测序及系统发育分析将DGGE条带中的优势条带和特异性的条带切割后，用无菌去离子水清洗3次，并用20 μL去离子水浸泡过夜，再以浸液为模板进行PCR扩增。用第2次PCR扩增时用的引物(无GC发夹)进行PCR扩增，体系和条件同1.4.2。PCR产物用UNIQ-10 DNA纯化试剂盒进行纯化，之后用大连宝生物公司的pMD19-T Vector试剂盒进行克隆。挑选白色菌落进一步测序，测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。测序结果通过BLAST程序在GenBank数据库中获取相似度较高的序列，然后使用MEGA 7.0采用Neighbor-Joining方法构建系统发育树[]。将测序得到的序列提交GenBank数据库，登录号为MK379976−MK379996。
2.1.1 微生物整体代谢活性AWCD值反映了样品所含微生物在群落水平上对不同类型碳源的利用能力，从功能代谢方面显示微生物群落结构多样性及其功能差异。由可知，最初的24 h，4个土壤样品的AWCD值差异不明显，培养48 h后AWCD值均呈现不断上升的趋势，各土壤微生物群落AWCD值差异逐渐加大，J2土壤样品的AWCD值快速上升，在所有样品中始终保持最大，而样品J4和J3的AWCD值呈现出相互交叉的变化过程，且AWCD值均高于J1土壤样品。来自金沙土遗址的4个土壤样品AWCD值变化趋势不同，表明不同劣化状态下土壤微生物碳源利用能力存在差异，J2样品中的土壤微生物代谢活性最高，J4和J3代谢活性相近但低于J2，J1样品中微生物活性最低。
2.1.2 微生物群落碳源利用水平分析按化学性质把Biolog-Eco微平板上的31种碳源分成6类，即多聚物类、碳水化合物类、氨基酸类、酚酸类、羧酸类和胺类[]。为4个样品对微孔板中6大类碳源的相对利用率分析结果。
结果显示，不同样品土壤微生物对6大类碳源的相对利用率较为平均，但都对碳水化合物类、多聚物类碳源表现出较高的利用率。样品J2对各类碳源的代谢水平均高于其它土壤样品，其碳源代谢的优势群落依次为碳水化合物类代谢群落、多聚物类代谢群落、酚酸类代谢群落等，J3和J4样品土壤中土壤微生物对各类碳源的利用率较为相似，但对碳源代谢的优势群落有差异，J4样品土壤中微生物对氨基酸类、胺类、酚酸类的利用率高于J3样品，而J3样品土壤中微生物对其它3种碳源的利用率则高于J4样品土壤中。相较于其它3个土壤样品，J1样品微生物对各类碳源的利用率最低，表明不同劣化状态下土壤微生物群落代谢功能类群存在差异。
2.1.3 遗址土壤微生物群落功能多样性分析采用丰富度指数、Shannon指数、Simpson指数和McIntosh指数对不同劣化状态下土壤微生物群落的功能多样性特征进行比较。如所示，土壤微生物群落代谢功能多样性指数在不同劣化状态下有一定变化。J2样品土壤微生物碳源利用丰富度指数(S)、Shannon指数(H′)、Simpson指数(D)和McIntosh指数(U)均表现为最高，与AWCD值随培养时间的变化曲线表现结果一致，其中丰富度指数(S)和McIntosh指数(U)显著高于其它样品，J4和J3样品土壤微生物丰富度指数(S)显著高于J1 (P < 0.05)。表明J2土壤样品中的微生物种类丰富，碳源利用度较高，活性较强，不同劣化状态下土壤微生物群落代谢特征存在差异，也说明金沙土遗址土壤微生物群落代谢功能受到土壤劣化的影响。
2.1.4 遗址土壤微生物代谢碳源利用的主成分分析主成分分析能够直观地表现出微生物群落代谢对一些碳源利用的偏好性，箭头所指的正方向即为正相关，说明微生物比较偏好利用此类碳源。
由可以看出，不同样品对碳源底物的利用情况不同，4个样品大致可以分成2种类型。一类为J2样品，比较偏好利用的碳源有：E2 (N-乙酰-D-葡萄糖胺)、D2 (D-甘露醇)、G1 (D-纤维二糖)、C1 (吐温40)、D1 (吐温80)，其中E2、D2、G1为碳水化合物类，C1、D1为多聚物类。另一类为J4、J3、J1样品，这3个样品的箭头方向较为一致，比较偏好利用的碳源有：E2 (N-乙酰-D-葡萄糖胺)、G1 (D-纤维二糖)、B2 (D-木糖)、H1 (α-D-乳糖)、B3 (D-半乳糖醛酸)、A2 (β-甲基-D-葡萄糖苷)、C1 (吐温40)、D1 (吐温80)、F1 (肝糖)，其中E2、G1、B2、H1、B3、A2为碳水化合物类，C1、D1、F1为多聚物类。4个遗址土壤样品所含微生物均对碳水化合物类以及多聚物类碳源利用率高，结果与各样品中微生物群落碳源利用水平分析结果一致，说明样品中利用碳水化合物和多聚物的微生物数量和代谢活性均高于其他微生物类群。
2.2.1 金沙土遗址土壤中细菌DGGE图谱及多样性分析微生物群落的遗传多样性在一定程度上可以通过DGGE条带的数量反映出来[]。从金沙土遗址不同劣化状态下土壤中分别提取DNA和RNA，PCR扩增产物进行DGGE分析结果显示()，从各样品中分离出数目不等的条带，不同样品各条泳道的强度和迁移率不相同。从整体上的条带数量来看，J2土壤样品在DNA和RNA水平上均有较多的条带处于同一位置，而其它样品条带位置差异较大()，样品J1的条带数量在DNA和RNA水平上都是最少的，RNA水平上的条带明显少于DNA水平，说明该样品中其具有活性的细菌多样性较为单一()。
依据DGGE电泳图谱中条带的数字化结果进行多样性指数计算，通过多样性指数(H′)、均匀度指数(J)、辛普森指数(D)以及优势度指数(C)等指数对不同劣化状态下各样品细菌多样性进行了综合分析()。结果表明，在DNA和RNA水平上，各土壤样品中细菌的各个指标都存在着不同程度的差异。在DNA水平上，J2样品的细菌多样性指数(H′)、均匀度指数(J)、辛普森指数(D)皆为最高，其次为J4、J3，而J1样品的细菌多样性指数(H′)、均匀度指数(J)、辛普森指数(D)均为最低。RNA水平上样品中细菌的各项指标呈现出与DNA水平一致的结果，表现为J2 > J4 > J3 > J1。综合各项指标来看，发生劣化的土壤中细菌多样性升高，表明金沙土遗址中细菌多样性和群落结构受土壤劣化的影响，可能对土遗址的保存具有潜在危害。
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